Liquid Chromatography of Natural Pigments and Synthetic Dyes
by Tibor Cserhati
by Tibor Cserhati
CONTENTS
Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX
1 Theory and practice of liquid chromatography (LC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 Sample preparation strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.1 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.2 Practical considerations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.1 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3.2 New theoretical advances in high-performance liquid
chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3.3 Practical considerations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.4 Supercritical fluid chromatography (SFC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
1.5 Various electrophoretic techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
1.5.1 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
1.5.2 New advances in the theory of electrophoretic techniques . . . . . . . 45
1.5.3 Practical considerations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2 Liquid chromatography of natural pigments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.1 Carotenoids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.1.1 Chemistry and biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.1.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.1.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.1.3.1 HPLC determination of carotenoid pigments in
samples of plant origin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.1.3.2 HPLC determination of carotenoid pigments in
human and animal tissues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
2.1.3.3 HPLC determination of carotenoid pigments
in miscellaneous organic matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
2.2 Flavonoids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
2.2.1 Chemistry and biochemistry of flavonoids . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
2.2.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
2.2.2.1 TLC separation of flavonoids in the extracts of
medicinal plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
2.2.2.2 TLC separation of flavonoids in model systems
and in miscellaneous matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
2.2.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
2.2.3.1 HPLC determination of flavonoids in plant extracts . . . . 162
2.2.3.2 HPLC determination of flavonoids in food and
food products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
2.2.3.3 HPLC determination of flavonoids in beverages . . . . . . . 189
2.2.3.4 HPLC determination of flavonoids in
other matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224
2.2.4 Electrophoretic methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
2.3 Anthocyanins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
2.3.1 Chemistry and biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
2.3.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
2.3.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
2.3.3.1 Determination of anthocyanins in wine . . . . . . . . . . . . . . 244
2.3.3.2 Determination of anthocyanins in fruits and
other beverages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
2.3.3.3 Determination of anthocyanins in miscellaneous
matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
2.3.4 Electrophoretic techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
2.4 Chlorophylls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
2.4.1 Chemistry and biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
2.4.2 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
2.4.2.1 Determination of chlorophylls in the marine
environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287
2.4.2.2 Determination of chlorophylls in miscellaneous
matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
2.5 Miscellaneous pigments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317
2.5.1 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
2.5.2 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
2.5.2.1 Miscellaneous pigments in living organisms . . . . . . . . . . 326
2.5.2.2 Miscellaneous pigments in foods and food
products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 328
2.5.2.3 Miscellaneous pigments in other matrices . . . . . . . . . . . . 337
2.5.3 Electrophoretic techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349
3 Liquid chromatography of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
3.1 Application of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
3.2 Toxicology of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
3.3 Environmental impact of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
3.3.1 Physical and physicochemical methods used for the
adsorption and degradation of dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372
3.3.2 Microbiological methods used for the degradation of dyes . . . . . . 373
3.4 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
3.4.1 Application of model systems in TLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
3.4.2 TLC determination of dyes in various matrices . . . . . . . . . . . . . . . 386
3.5 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
3.5.1 HPLC determination of synthetic dyes in animal tissues . . . . . . . . 403
3.5.2 HPLC determination of synthetic dyes in foods, food
products and waters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412
3.5.3 Degradation of synthetic dyes by physicochemical methods
followed by HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
3.5.4 Degradation of synthetic dyes by microbiological methods
followed by HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
3.5.5 HPLC separation of synthetic dyes in model mixtures . . . . . . . . . 480
3.5.6 Miscellaneous applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 511
3.6 Electrophoretic methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516
3.6.1 Determination of dyes in foods and food products . . . . . . . . . . . . 516
3.6.2 Environmental and toxicological application of
electrophoretic methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 528
3.6.3 Separation of model mixtures of dyes by electrophoretic
methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 545
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561
Subject Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573
1 Theory and practice of liquid chromatography (LC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 Sample preparation strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.1 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2.2 Practical considerations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.1 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3.2 New theoretical advances in high-performance liquid
chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3.3 Practical considerations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.4 Supercritical fluid chromatography (SFC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
1.5 Various electrophoretic techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
1.5.1 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
1.5.2 New advances in the theory of electrophoretic techniques . . . . . . . 45
1.5.3 Practical considerations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2 Liquid chromatography of natural pigments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.1 Carotenoids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.1.1 Chemistry and biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.1.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.1.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.1.3.1 HPLC determination of carotenoid pigments in
samples of plant origin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.1.3.2 HPLC determination of carotenoid pigments in
human and animal tissues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
2.1.3.3 HPLC determination of carotenoid pigments
in miscellaneous organic matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
2.2 Flavonoids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
2.2.1 Chemistry and biochemistry of flavonoids . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
2.2.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
2.2.2.1 TLC separation of flavonoids in the extracts of
medicinal plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
2.2.2.2 TLC separation of flavonoids in model systems
and in miscellaneous matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
2.2.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
2.2.3.1 HPLC determination of flavonoids in plant extracts . . . . 162
2.2.3.2 HPLC determination of flavonoids in food and
food products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
2.2.3.3 HPLC determination of flavonoids in beverages . . . . . . . 189
2.2.3.4 HPLC determination of flavonoids in
other matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224
2.2.4 Electrophoretic methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233
2.3 Anthocyanins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
2.3.1 Chemistry and biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
2.3.2 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
2.3.3 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
2.3.3.1 Determination of anthocyanins in wine . . . . . . . . . . . . . . 244
2.3.3.2 Determination of anthocyanins in fruits and
other beverages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
2.3.3.3 Determination of anthocyanins in miscellaneous
matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
2.3.4 Electrophoretic techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
2.4 Chlorophylls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
2.4.1 Chemistry and biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
2.4.2 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
2.4.2.1 Determination of chlorophylls in the marine
environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287
2.4.2.2 Determination of chlorophylls in miscellaneous
matrices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
2.5 Miscellaneous pigments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317
2.5.1 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
2.5.2 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
2.5.2.1 Miscellaneous pigments in living organisms . . . . . . . . . . 326
2.5.2.2 Miscellaneous pigments in foods and food
products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 328
2.5.2.3 Miscellaneous pigments in other matrices . . . . . . . . . . . . 337
2.5.3 Electrophoretic techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349
3 Liquid chromatography of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
3.1 Application of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369
3.2 Toxicology of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
3.3 Environmental impact of synthetic dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
3.3.1 Physical and physicochemical methods used for the
adsorption and degradation of dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 372
3.3.2 Microbiological methods used for the degradation of dyes . . . . . . 373
3.4 Thin-layer chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
3.4.1 Application of model systems in TLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
3.4.2 TLC determination of dyes in various matrices . . . . . . . . . . . . . . . 386
3.5 High-performance liquid chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402
3.5.1 HPLC determination of synthetic dyes in animal tissues . . . . . . . . 403
3.5.2 HPLC determination of synthetic dyes in foods, food
products and waters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412
3.5.3 Degradation of synthetic dyes by physicochemical methods
followed by HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432
3.5.4 Degradation of synthetic dyes by microbiological methods
followed by HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469
3.5.5 HPLC separation of synthetic dyes in model mixtures . . . . . . . . . 480
3.5.6 Miscellaneous applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 511
3.6 Electrophoretic methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516
3.6.1 Determination of dyes in foods and food products . . . . . . . . . . . . 516
3.6.2 Environmental and toxicological application of
electrophoretic methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 528
3.6.3 Separation of model mixtures of dyes by electrophoretic
methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 545
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561
Subject Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573